Chlamydomonas reinhardtii est l'organisme modèle le plus important de la lignée des algues vertes, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications biotechnologiques. Nous utilisons Chlamydomonas pour essayer de comprendre comment un organisme unicellulaire s'adapte pour survivre dans un environnement hostile. Bien que certaines expériences indiquent l'existence d'une mort cellulaire programmée (PCD) en réponse à des stress sévères chez Chlamydomonas, les mécanismes contrôlant ce processus et les voies de signalisation impliquées, n'ont pas encore été identifiés (de Carpentier et al., 2019). De manière surpenante, nous avons récemment montré que les cellules de Chlamydomonas qui s'autodétruisent émettent des molécules dans le milieu de culture qui permettent une meilleure résistance et survie des autres cellules de la population, mettant en évidence l'existence de mécanismes altruistes. Nous avons également découvert qu'en réponse à des stress plus modérés, les cellules s'agrègent pour former des structures multicellulaires dans lesquelles les algues peuvent être protégées. L'agrégation cellulaire serait un stade intermédiaire où le stress n'est pas assez fort pour induire une PCD, mais où les cellules collaborent néanmoins pour se protéger.

Comme Chlamydomonas se prête à des approches génétiques puissantes, nous avons construit une bibliothèque de mutants insertionnels, à partir de laquelle nous avons identifié deux familles de mutants originaux : les mutants survivants (sur) qui ne déclenchent plus de PCD en réponse à plusieurs stress, et les mutants socializer (saz) qui forment des agrégats spontanément. Nous avons identifié les gènes affectés dans la plupart de ces mutants. Une caractérisation plus poussée des mutants par des études RNA-Seq et de protéomique quantitative a été réalisée et nous a permis d'obtenir une meilleure vue d'ensemble des mécanismes contrôlant la PCD et l'agrégation chez Chlamydomonas. Notre approche multi-omique nous a permis d'identifier des régulateurs clés potentiels de la PCD et de l'agrégation chez Chlamydomonas. Ces candidats sont ensuite testés pour leur implication dans l'agrégation ou la PCD en utilisant des mutants obtenus à partir du Chlamydomonas Library Project (CLiP) (Li et al., 2019).

La dynamique et le mode de formation des structures multicellulaires chez Chlamydomonas étant très mal connus, nous développons également des outils microfluidiques qui nous permettent de suivre ce processus en détail sur une période de temps allant de plusieurs heures à plusieurs jours. Certains des candidats que nous avons identifiés dans nos études multi-omiques peuvent être fusionnés à des protéines fluorescentes spécifiques, grâce à des outils développés dans notre laboratoire (Crozet et al., 2018 ; de Carpentier et al., 2020), afin de suivre leur mouvement pendant la même période, et de mettre en évidence leur rôle potentiel.

L'agrégation des cellules sur une longue période est l'une des hypothèses classiquement formulées pour expliquer la transition entre unicellularité et multicellularité au cours de l'évolution. Nos recherches sur les mécanismes conduisant à l'agrégation en réponse à un stress et la caractérisation des mutants saz pourraient donc également contribuer à une meilleure compréhension de l'apparition de la multicellularité chez les Volvocales.

Références

• de Carpentier, F., Le Peillet, J., Boisset, N.D., Crozet, P., Lemaire, S.D., and Danon, A. (2020). Blasticidin S Deaminase: A New Efficient Selectable Marker for Chlamydomonas reinhardtii. Front. Plant Sci. 11
• de Carpentier, F., Lemaire, S.D., and Danon, A. (2019). When Unity Is Strength: The Strategies Used by Chlamydomonas to Survive Environmental Stresses. Cells 8: 1307
• Crozet, P. et al. (2018). Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synth. Biol. 7: 2074–2086.
• Li, X. et al. (2019). A genome-wide algal mutant library and functional screen identifies genes required for eukaryotic photosynthesis. Nat Genet 51 : 627-635.

Crédit illustration : Jeanne Le Peillet @jeannedart

La photosynthèse est la principale source de carbone et d'énergie pour la biosphère. Le cycle de Calvin-Benson fixe le dioxyde de carbone atmosphérique en trioses organiques dans le stroma des chloroplastes. Si les onze activités catalytiques constituant le cycle s'avèrent individuellement nécessaires à la fixation, nous disposons de peu d'informations sur la coopération supra-moléculaire entre ces enzymes. Afin de comprendre le fonctionnement du cycle de Calvin-Benson en tant que système intégré, le projet CALVINTERACT ambitionne de déterminer les structures cristallographiques de trois complexes multi-protéiques, de caractériser in vitro leurs interactions protéine-protéine et de détecter des complexes dans des extraits de cellules. Nous compléterons les analyses des interactions natives par la création de complexes multi-enzymatiques artificiels, suivant une approche de biochimie synthétique. Les effets sur l'activité photosynthétique seront mesurés dans l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii.

Le projet propose de définir dans un organisme unicellulaire modèle, l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii, l'ensemble des structures des enzymes de Calvin Benson permettant la fixation de carbone. Outre les structures individuelles nouvellement déterminée pour des enzymes chloroplastiques, le projet s'attache à décrire les états homo-oligomériques de ces protéines, leurs interactions avec des régulateurs redox, les thiorédoxines, et les interactions protéine-protéine que les enzymes peuvent faire entre elles. Par biologie de synthèse, de nouvelles interactions sont conçues et leurs effets testés sur l'efficacité enzymatique et le métabolisme.

Le projet dépend premièrement de la détermination de structures à haute résolution par cristallographie aux rayons X d'enzymes recombinantes surexprimées dans l'hôte Escherichia coli. Au cours des premiers mois du projet, nous avons soumis une des enzymes à une analyse par microscopie électronique. Les états complexés des protéines sont recherchés dans des extraits d'algues, par chromatographies d'abord et co-immuno-précipitations à l'avenir. Une stratégie de prédiction des interactions protéine-protéine par analyse in silico a été mise en place dans le cadre d'une nouvelle collaboration.

Les structures de toutes les enzymes non encore déterminées, sauf une, ont été obtenues. Un nouveau régulateur rédox a été identifié par l'analyse des résidus de surface du modèle cristallographique. Des états de hauts poids moléculaires de certaines enzymes ont été observés sur chromatographie d'exclusion stérique, ces expériences appellent des validations et des caractérisations plus avancées. L'isolation de complexes multi-enzymatiques in vitro et la construction de complexe artificiels sont les objectifs principaux faisant l'objet des efforts de la deuxième phase du projet.