Spectrométrie de masse

Expertise et instrumentation en spectrométrie de masse dans le domaine de la protéomique :

Identification de protéines à partir de gels d’électrophorèse 1D ou 2D ou d’extraits cellulaires complexes, caractérisation de modifications post-traductionnelles, approches quantitatives et spécifiques, identification de complexes non-covalents ….

Prestations simples, ou travail de collaborations à moyen et long termes, recherches méthodologiques avec les milieux académiques (UPMC, universités/CNRS/INSERM) et industriels. 

La Plate-Forme offre une expertise et une instrumentation généralistes dans le domaine de la protéomique basées sur les techniques et méthodes de la spectrométrie de masse. La plate-forme actuelle est composée d’un assistant ingénieur (UPMC-IBPS), d’une maître de conférences (UPMC) et d’un directeur de recherche (CNRS) qui participent à l’entretien du parc instrumental, à son évolution, à la mise en œuvre des prestations, des travaux de collaboration et des travaux de recherche en méthodologies. La plate-forme participe également à des formations au niveau des masters M2 et des Ecoles Doctorales pour l’utilisation en libre-service d’un spectromètre de masse MALDI-TOF.

La plate-forme offre une instrumentation la plus généraliste possible avec les modes d’ionisation complémentaires MALDI et ESI et les analyseurs temps-de-vol (Time-Of-Fligth), quadripolaire et Orbitrap. Ces spectromètres de masse (MS) permettent des mesures de masse moléculaire précises voire très précises et l’obtention d’information de séquences par spectrométrie de masse tandem (MS/MS) basée sur la fragmentation d’ions sélectionnés. Les analyses sont réalisées essentiellement sur les biomolécules peptides et protéines à partir de mélanges simples ou complexes (extraits cellulaires). Pour ces derniers un couplage avec des méthodes chromatographiques microLC ou nanoLC est réalisé. Des analyses et travaux de collaboration portant sur de plus petites molécules (oligonucléotides, stéroïdes…) sont également réalisés.

Les prestations et demandes de collaborations avec cette plate-forme sont réalisées pour des laboratoires de l’UPMC (IBPS et Institut de Chimie, Physique et Médecine), pour ceux des Organismes Publiques de Recherche (Universités, CNRS, INSERM, INRA) et d’entreprises privées. 

Equipements

Grande complémentarité entre les différents spectromètres au niveau des modes d’ionisations, des analyseurs, des modes de fragmentation, de la simplicité et la robustesse de l’analyse. Tous les appareils sont connectés à des banques de données (NCBI, SwissProt ...) à travers des moteurs de recherche (Mascot, Sequest ...)

  • MALDI-TOF (DE-Pro, ABSciex)

    Equipé d’un laser azote (l=337 nm, 20 Hz) L’analyseur Temps-de vol possède un mode linéaire (gamme m/z > 1000) et un mode réflecteur (gamme m/z 500 - 6000). Ce spectromètre est réservé à une utilisation en libre-service pour les personnels de l’UPMC et les étudiants, doctorants et post-doctorants.

    Sur les mêmes cibles une analyse plus poussée (MS/MS) sur le MALDI-TOF-TOF est réalisable.

  • MALDI-TOF-TOF (4700 Proteomic Analyzer, ABSciex)

    Equipé d’un laser NdYAG (l=355 nm, 200 Hz), ce spectromètre de masse temps de vol est équipé d’un mode linéaire avec un détecteur haute masse (CovalX) pour les protéines de masse élevée (MM < 106 Da) et d’un mode réflecteur très résolutif (R~20 000) dans la gamme m/z < 6000 pour les études de cartographie peptidique impliquant un nombre modéré de peptides. Enfin un mode tandem (MS/MS) avec une cellule de collision (CID haute énergie) permet d’opérer la fragmentation puis l’analyse des fragments pouvant conduire à des informations de séquences (identification de protéines, modifications post-traductionnelles, …) et dans l’analyse de peptides (issus de synthèse chimique, antimicrobien, peptides vecteurs). Possibilité de couplage avec une chromatographie liquide (nanoLC) via un robot (Probot, Dionex).

  • ESI-Qtrap (QTRAP LC/MS/MS System, ABSciex)

    Ce spectromètre comporte 3 quadripôles en série dont le dernier est un piège linéaire. Gamme m/z < 1700. Il est couplé à une chromatographie liquide (Ultimate 3000 Dionex) de moyen débit (µL/min). Il est actuellement dédié à l’analyse de petites biomolécules (stéroïdes, oligonucléotides….) présentes dans des mélanges complexes. Il peut travailler en mode simple (MS) ou en mode tandem (MS/MS) avec et sans couplage avec les techniques LC. Ce spectromètre possède le mode très utile « MRM » (Multiple Reaction Monitoring) permettant de ne rechercher qu’une espèce très minoritaire connaissant sa masse moléculaire et la masse d’un de ses fragments et de la quantifier.

  • ESI-Orbitrap (LTQ-Orbitrap XL+ ETD, ThermoFisher Scientific)

    Ce spectromètre se caractérise par un couplage entre un piège linéaire (LTQ) et un analyseur Orbitrap (gamme m/z < 2000 en routine), ce dernier offrant des mesures de grande résolution (R ~100 000) et de grande précision (~ppm). Il peut travailler en mode infusion ou en couplage avec une chromatographie liquide nano-débit (nL/min). Ce dernier mode est utilisé essentiellement en protéomique dans l’identification et la caractérisation de protéines dans des mélanges complexes (lysats cellulaires….). Mesure de masse exacte possible (gamme m/z < 400) pour certaines applications.

    Ce spectromètre comporte également trois modes de fragmentation induites par : des collision de basse énergie (CID), de haute énergie (HCD) et par des dissociations induites par des transfert d’électrons (ETD).

Prestations

Présentation des prestations :

Discussion souhaitée avec le demandeur afin de déterminer la meilleure stratégie d’analyse et l’instrumentation la plus adaptée. Le personnel de la plate-forme peut apporter un soutien scientifique au niveau de l’interprétation des données.

Types de prestations :

  • Spectromètre de masse MALDI-TOF en libre-service : après une formation de 2 jours assurée par le personnel de la plate-forme, l’utilisateur peut procéder à la préparation de ses cibles, à leur analyses et à leurs traitements. Une assistance scientifique et technique est assurée. Réservation de la séance par téléphone (01 44 27 34 09) ; durée de la séance 1 heure.
  • Demande d’analyse-prestation : le demandeur ne peut utiliser lui-même les spectromètres de masse. Il peut dans certaines conditions assister à l’analyse et au traitement des informations. Les spectres informatifs peuvent être envoyés sous forme de fichier pdf. En aucun cas le demandeur ne doit connecter une clé USB aux systèmes informatiques associés aux spectromètres de masse.
  • Projet collaboratif à long terme : il est possible dans ce cas que les utilisateurs puissent participer à l’exploitation des données via une console de traitements dans le cas de recherches en banques de données en protéomique.

Méthodologies

  • Identification de protéines : Analyses MS et MS/MS de protéines (extraits gel 1D, 2D) ou à partir de mélanges complexes digérés enzymatiquement. Digestion trypsine pouvant être effectuée par la PTF : nanoLC ESI Orbitrap, MALDI-TOF-TOF.
  • Caractérisation de modifications post-traductionnelles : méthodologies de purification et d’enrichissement pour phosphopeptides et phosphoprotéines.
  • Quantification : méthodes ITRAQ, et SILAC, techniques du standard interne, diméthylation.
  • Analyses MRM : recherche de composés connus petites biomolécules (ESI-QTrap) dans mélanges complexes.
  • Etude de l’interactome : méthodes de cross-linking et photomarquage pour l’étude des complexes protéiques
  • Mise au point de méthodologies adaptées suivant les besoins des demandeurs (travail de collaboration)
  • Développements méthodologiques :

Méthodes de quantification en protéomique de type « label free », diméthylation, SILAC… ;

Optimisations des outils analytiques (nanoLC, LTQ-Orbitrap) pour augmenter le nombre de protéines identifiées en protéomique ;.

Recherches sur le production d’ions fortement chargés en ionisation MALDI pour des applications en identification Top Down en protéomique.

Collaborations

(hors UPMC)

  • B Marie and A Marie (MNHN)
  • X. Du (University North Carolina, USA)
  • L Le Sergeant d’Hendecourt (Instit Astrophys Spatial, Orsay)