Interactions moleculaires

Le service d’Interactions moléculaires offre une expertise en analyse et caractérisation des interactions entre les biomolécules (protéines, peptides, acides nucléiques, lipides sucres, petites molécules...) sans marquage et en temps réel, par résonance de plasmon de surface (SPR) utilisant le Biacore 3000.Ce service est animé par un ingénieur qui étudie et réalise les projets avec les utilisateurs. Il assure la maintenance et le contrôle qualité de l’équipement ainsi que la formation et l’accompagnement des utilisateurs. Il participe au développement technologique et méthodologique. D’autre part, de multiples compétences et technologies pour l’étude d’interactions moléculaires sont accessibles via des collaborations avec des équipes de recherches de l’IBPS.

Le système BIACORE® est un biocapteur utilisant le principe physique de la résonance plasmonique de surface (SPR). Il permet de mesurer en temps réel, et sans marquage spécifique, les caractéristiques d'interaction entre deux molécules sur une surface biospécifique. Pour cela, une des molécules (le ligand) est immobilisée sur la surface " sensor " et l'autre (l'analyte) est injectée. Le principe de détection par SPR quantifie des changements de l'indice de réfraction près de la surface, reliés à la variation de masse à la surface du biocapteur, due à la formation et à la dissociation des complexes moléculaires.

La plateforme interactions moléculaires met à disposition le Biacore 3000 pour des utilisateurs confirmés et propose une aide à la conception des manipulations pour les utilisateurs qui découvrent la SPR.


Afin de veiller au bon fonctionnement de l'appareil, toutes les manipulations seront réalisées sous le tutorat de M. Tahar BOUCEBA.

Equipements

  • Biacore 3000 ( GE Healthcare)
    Cette machine est sous contrat de maintenance constructeur depuis sa mise en service. Ce point est très important pour garantir une très bonne qualité des résultats et une sensibilité exemplaire de la machine:
  • Chimies de couplage variées: couplages Amine, Aldéhyde, Thiol... , NTA, Streptavidine-Biot, GST capture, Hydrophobic capture (C18 pour les liposomes...)
  • Analyse de faibles quantités d'échantillons non marqués (ng de protéines) dans une cellule d'analyse (flowcell) de faible volume (60 nl).
  • Haute sensibilité (1 fentomole d'une protéine de 10 KDa suffit pour générer un signal 10 fois supérieur au bruit de fond), petites molécules (>180 Da).
  • Machine conçue pour effectuer uneanalyse en temps réel de la formation/dissociation des complexes (quantification des affinités de 10-3 à 10-12 M).
  • Quatre pistes (flowcell) peuvent être utilisées en série, ce qui permet une étude simultanée sur trois échantillons différents au maximum (au moins un Flowcell est utilisé comme contrôle négatif).
  • Doté d'un automate programmable acceptant deux plaques de microtitration de 96 puits et d'un rack supportant huit flacons de solution d'élution différents.
  • Fonction "Sample Recovery" permettant la récupération de ligands inconnus préalablement liés à leurs "partenaires récepteurs" immobilisés sur la sensor chip, et à leur identification par spectrométrie de masse (ligand fishing)
  • Experion: (Biorad) La plateforme d'Interactions moléculaires est dotée d'un ExperionTM de la société Biorad®.
    Il s'agit d'un système de micro-électrophorèse automatisée sur puces, qui permet de faire migrer des échantillons de protéines, d'ARN ou d'ADN (documents 1 et 2) en 30 minutes. Ceci, dans le but de visualiser la qualité des fragments d'ARN, d'ADN et le degré de pureté et d'intégrité des protéines en vue d'une analyse biologique.
    La machine est fonctionnelle: elle a déjà été testée sur les protéines et sur les acides nucléiques.

Prestations

Il faut compter deux semaines en moyenne pour mettre en place un projet et avoir des résultats préliminaires:

  • Prise de contact avec l'ingénieur en charge du service pour étudier la faisabilité du projet (caractéristiques biologiques de l'échantillon, point isoélectrique des protéines, stabilité, degré de pureté, choix de la stratégie de greffage...)
  • Contrôle qualité et degré de pureté des protéines par le système Experion (cf équipements), cette étape est obligatoire pour avoir une bonne visibilité sur la qualité des échantillons afin de s'assurer de la bonne interprétation des résultats et savoir utiliser les bons contrôles (négatifs et positifs) de l'expérience BIAcore.
  • Immobilisation d'un des deux partenaires sur la puce, choix de la chimie de couplage
  • validation de l'immobilisation, contrôle spécificité de la surface et stabilité du ligand
  • réalisation des interactions, suivi de la stabilité de l'interaction et de l'efficacité de régénération, automatisation des étapes...
  • Entretien quotidien de la machine après chaque expérimentation, désorption des molécules fixées sur la microfluidie suite à l'utilisation journalière.
  • Analyse des résultats et participation à la publication des donnés s'il y a lieu de publication

Quelques conseils pratiques:

  • Le contrôle de la qualité des échantillons avant et/ou pendant une expérience BIAcore est nécessaire et obligatoire. Ce contrôle est possible en utilisant l'Experion (Biorad). L'analyse par cette machine de micro-électrophorèse permet de nous indiquer un profil de migration électrophorétique classique, accompagné d'un profil de fluorescence. Le profil de fluorescence présente les résultats sous forme de pics indiquant le poids moléculaire de la protéine et sa concentration. Si la protéine est pure et non dégradée, il y'aura un seul beau pic uniforme indiquant le poids moléculaire attendu et la concentration, si la protéine et dégradée et/ou impure, il y aura plusieurs pics non uniformes indiquant chacun le poids moléculaire de la protéine contaminant présente. Ce contrôle est simple et rapide, il est possible d'analyser 10 échantillons sur une puce d'électrophorèse en 1h30.
  • Il est très important de connaitre le point isoélectrique de la protéine à immobiliser par couplage amine pour pouvoir faire le bon choix du tampon d'immobilisation
  • Lors d'une immobilisation covalente par couplage amine, la pureté du partenaire à immobiliser est indispensable pour éviter d'immobiliser des contaminants en même temps. La pureté est facultative dans le cas d'une immobilisation non covalente (utilisant un tag peptidique, biotine, protéine de fusion...), elle l'est également pour l'analyte (molécule injectée dans le flux).
  • Le tampon dans lequel se trouve la molécule à immobiliser par couplage amine ne doit pas contenir d'amines primaires au risque d'interférer sur le couplage
  • Les concentrations généralement utilisées lors d'un couplage amine varient entre 10 et 100 µg/ml (pour la molécule à immobiliser), les analytes (le deuxième partenaire à injecter dans le flux de tampon) sont injectées à des volumes qui varient entre 20 et 60 µl/cycle de binding (1 ou 2 ml d'échantillon suffisent pour l'étude d'un projet)
  • Les concentrations d'analytes varient entre 0,5 nM et 1µM (selon la force et les caractéristiques de l'interaction)
  • Il est vivement conseillé d'avoir un maximum d'informations sur les caractéristiques biochimiques des molécules à étudier. Il est très souhaitable de nous fournir les références bibliographiques des travaux déjà réalisés sur vos molécules afin de choisir le mode opératoire le plus convenable
  • L'utilisation de certaines solutions et composés (Glycerol, DMSO, saccharose, Tris, NaOH, NaCl, SDS....) est soumise à des restrictions de concentrations et de temps de contact au risque d'abimer la microfluidie de la machine. Le tableau joint précise les règles d'utilisation de ces solutions sur le système.

Méthodologies

La technologie BIA s'applique à un grand panel de molécules : (protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, petites molécules, drogues, peptides, cellules, bactéries, particules virales...)

L'étude des interactions moléculaire par le Biacore permettent de :

  • Valider l'interaction entre deux molécules, cette technique seule permet de valider les interactions et n'a pas besoin d'autres techniques complémentaires.
  • Caractériser les interactions en réalisant des études cinétiques pour extraire les données cinétiques Kon, Koff, KD...
  • Déterminer les concentrations actives d’un analyte (RU/PM=pmol)
  • Identifier des partenaires d’interaction (ligand fishing) en réalisant le couplage Biacore-Spectrométrie de masse
  • Valider des molécules recombinantes, cribler et sélectionner les meilleurs clones d’anticorps
  • assurer le suivi de l'assemblage de deux ou plusieurs partenaires, simple ou conditionnel (effet d'inhibiteurs, des ions, de l'ATP, de modifications post-traductionnelles...), y compris pour des protéines membranaires (utilisation possible de membranes biologiques, de protéoliposomes ou de liposomes).

Les domaines d'applications peuvent être très variés :

  • Caractérisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux (sélection, spécificité, isotypage, cartographie épitopique...).
  • Biologie moléculaire (interactions ADN-protéine, ADN-ADN, ARN-protéine, visualisation d'hybridation et de polymérisation).
  • Interaction entre ligand et récepteur (détermination des résidus régulant la reconnaissance et la stabilité des complexes, étude de mutants).
  • Transduction de signal (interaction entre peptides contenant une phosphotyrosine et domaines SH2, protéine G, cascade d'activation de phosphorylases...).
  • Oligosaccharides et molécules glycosylées (néoglycoprotéines, glycosylases, interactions lectines-sucres). 
  • Biologie cellulaire (interaction entre ligands et récepteurs cellulaires, études de lignées transfectées surexprimant un déterminant membranaire).