Compartimentation et trafic intracellulaire des mRNP

Dans les cellules eucaryotes, les ARNm cytoplasmiques peuvent être traduits, dégradés ou stockés, selon les facteurs qui leur sont liés. Cette régulation post-transcriptionnelle est impliquée dans tous les aspects de la physiologie cellulaire, dans les cellules germinales et somatiques.

De façon remarquable, la plupart des facteurs impliqués s'accumulent dans des granules ribonucléoprotéiques (RNP) cytoplasmiques dépourvus de membrane. Malgré des noms, des tailles et des compositions qui varient selon les organismes modèles, les types cellulaires et les conditions environnementales, tous ces granules sont constitués d’ARNm dont la traduction est réprimée. En l’absence de procédure expérimentale pour les purifier et en identifier les composants protéiques et ARN, leur fonction reste énigmatique. Comment s’assemblent-ils ? Contiennent-ils tous les ARNm réprimés ou seulement une sous-population ? Quel est l'avantage de ces macro-aggrégats par rapport à des molécules dispersées dans le cytoplasme ? Nous nous intéressons à ces questions en utilisant une combinaison d'approches expérimentales incluant des techniques de biochimie et d'imagerie cellulaire, ainsi que des analyses protéomiques et transcriptomiques. Les granules étudiés sont principalement les P-bodies dans les cellules humaines et les granules germinaux chez C. elegans.

Résultats importants

Ayant montré précédemment que l’hélicase à DEAD-box DDX6 est nécessaire pour assembler des P-bodies dans les cellules humaines, nous avons focalisés nos études sur cette protéine. In vitro, DDX6 lie l’ARN avec une forte affinité et sans spécificité de séquence, conduisant au déroulement de l’ARN. Dans les cellules, DDX6 est extrêmement abondante, sept fois plus que les ARNm. Elle multimérise le long des ARNm réprimés. En microscopie électronique, elle apparaît extrêmement concentrée dans les P-bodies, décorant des fibres d’ARN réprimés. Des études réalisées dans divers organismes modèles, ont montré que DDX6 s’intègre dans des complexes variés, comme le complexe de décapping et des complexes de répression de la traduction. Dans les cellules humaines, nous avons identifié plus de 200 protéines partenaires par la méthode de TAP-tag suivi d’une analyse de spectrométrie de masse. Les plus abondantes sont les protéines du complexe de décapping, un complexe de répression CPEB-like, et un complexe ATXN2/2L moins bien caractérisé. Seuls les deux premiers complexes sont présents dans les P-bodies, et seules les protéines 4E-T et LSM14A du complexe CPEB-like sont nécessaires avec DDX6 dans l’assemblage des P-bodies. Ceci suggère que la fonction de ces granules est directement liée à la répression de la traduction plutôt qu’à la dégradation des ARNm.

Projets

Après avoir obtenu cette vue générale de l’interactome de DDX6 dans les cellules humaines, nous cherchons maintenant à déterminer quels sont les ARNm régulés par DDX6, et par quel mécanisme, dégradation des ARN ou répression de la traduction. Nous utilisons d’une part un gène rapporteur sur lequel nous fixons artificiellement DDX6 (tether assay). D’autre part, nous avons mené une expérience de polysome profiling après déplétion de DDX6 par des siARN. Cette approche nous permet d’avoir une vue d’ensemble des voies de régulation qui impliquent DDX6, en distinguant régulations de la stabilité des ARNm et régulations de leur traduction. Par ailleurs, nous avons mis au point la première méthode de purification efficace des P-bodies, qui va nous permettre d’en identifier tous les composants protéiques et ARN. Nous espérons que ceci constituera une avancée importante pour l’étude des granules RNP. Enfin, nous analysons l’importance fonctionnelle des granules RNP, en étudiant les granules germinaux dans le modèle C. elegans. Régulés au cours de la différenciation des ovocytes, ils atteignent des tailles très importantes dans les ovocytes quiescents. En utilisant des mutants ne formant pas de granules ou formant des granules anormaux, il est possible de questionner les fonctions de ces granules dans le stockage des ARNm maternels et dans la viabilité des embryons à venir.

Collaborations

  • Philippe Andrey: INRA-AgroParisTech, Versailles-Grignon, France
  • Thomas Boudier: UPMC, Paris, France
  • Eric Deprez: ENS Cachan, France
  • Eric Le Cam: Institut Gustave Roussy, Villejuif, France
  • Julien Mozziconacci: LPTMC, UPMC, Paris, France
  • Gérard Pierron: Institut Gustave Roussy, Villejuif, France
  • Raquel Seruca: IPATIMUP, University of Porto, Portugal
  • Nancy Standart: Dept of Biochemistry, University of Cambridge, UK