Stress et Vieillissement des Neurones (NSA)

Notre équipe cherche à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les phénomènes de réponse au stress (e.g. physiques, oxydants, par carence, xénobiotiques, inflammatoires) et les processus de vieillissement normal et pathologique du neurone et de ses compartiments. Dans notre approche, les interactions entre les neurones et d'autres types cellulaires (cellules gliales, macrophages infiltrés) sont prises en compte. 

Nos 3 axes principaux :

1/ Les mécanismes impliquant la Caspase-2 (Casp2, Nedd2, Ich-1) au cours des voies de dégénérescence locales (e.g. synaptique) et de la mort cellulaire régulée (Regulated Cell Death ; RCD) dans les neurones ;

2/ Le rôle cytoprotecteur du NAD+, de son précurseur, le nicotinamide riboside (NR), et l'importance de son métabolisme lors de stress neuronaux (e.g. excitotoxicité, peptide β-amyloïde) ;

3/ Le développement de la technologie microfluidique et de méthodes de (co-)cultures à architectures définies (e.g. Nerve-on-Chip). Cet axe est transversal et multi-collaboratif.

Au plan méthodologique, notre spécificité est de développer des (co-) cultures cellulaires microfluidiques avec des outils génétiques et pharmacologiques, auxquels nous combinons diverses techniques d'analyses par microscopie de fluorescence, cytométrie en flux, biochimie et biologie moléculaire, ainsi que des méthodes spécifiques à l'étude des processus de mort cellulaire. 

Axe 1 : Caspase-2 et voies de mort cellulaire régulées au sein du neurone

L'objectif général de cet axe est de comprendre comment les voies de dégénérescence et de mort cellulaire régulées sont mises en œuvre dans les compartiments neuronaux au cours de diverses situations de stress aigu ou chronique et d'identifier de nouvelles cibles pharmacologiques.

Les caspases sont les effecteurs centraux de l'apoptose et de l'inflammation. Elles sont aussi impliquées dans le contrôle d'autres voies de mort cellulaire régulée (RCD) telles que la nécroptose et la pyroptose, et dans des fonctions biologiques variées telles que la différenciation cellulaire, le remodelage du cytosquelette, la plasticité neuronale, et lors de la dégénérescence axonale et synaptique, développementale ou pathologique. Nous nous intéressons plus particulièrement à la Casp2 dont les rôles apoptotiques et non-apoptotiques restent mal définis. La Casp2 est impliquée dans l'apoptose induite par les stress cellulaires (e.g. génotoxiques, métaboliques, infectieux; Bouchier-Hayes, 2009; Buchakjian & Kornbluth. 2010) et est aussi capable de réprimer l'autophagie (Tiwari et al., 2014). Divers travaux suggèrent que la Casp2 pourrait jouer un rôle dans le contrôle du vieillissement, de la ploïdie, et (dans certains contextes) comme suppresseur de tumeur (Fava et al.,J Cell Sci. 2012).

La Casp2 est la principale Caspase responsable de la mort des cellules des ganglions rétiniens après un traumatisme direct (Vigneswara & Ahmed2016). Elle est aussi impliquée dans plusieurs voies de mort neuronale pathologiques, telles que les ischémies cérébrales néonatales (Carlssonet al., 2011), et les effets neurotoxiques de la protéine β-amyloïde (Troyet al.,2000). Cette enzyme est présente dans les corps cellulaires et dans les épines dendritiques et pourrait agir comme médiateur de la synaptotoxicité de la protéine β-amyloïde (Pozueta Jet al.,2013; Jacotot E. 2015 WO2016112961 A1). Nos données suggèrent un rôle de la Casp2 dans les synapses en réponse au peptide β-amyloïde. Nous explorons les mécanismes moléculaires mis en jeu en établissant des cultures de neurones conventionnelles ou microfluidiques. Pour contourner les compensations observées dans les souris constitutivement déficientes en Casp2 (Troyet al.,2001), nous avons floxé le gène murin de la Casp2 puis obtenu des souris homozygotes pour la présence des séquencesloxP(C57BL/6J-Casp2flox/flox). Nous utilisons ces souris et leurs neurones pour étudier plus avant le rôle de la Casp2.

D'autre part, nous développons des inhibiteurs sélectifs de la Casp2. La majorité des inhibiteurs de Caspases sont des peptides synthétiques analogues de substrats, qui agissent en compétiteurs des substrats naturels vis-à-vis du site actif. La conservation structurale entre les différentes Caspases constitue un défi pour le développement d’inhibiteurs sélectifs. Ainsi, Les inhibiteurs actuels qui ciblent la Casp2 sont aussi des inhibiteurs efficaces de la Casp3. (Chauvieret al. 2011). Nous avons généré récemment une nouvelle série d'inhibiteurs sélectifs vis-à-vis de la Casp2 (Jacotot E. 2016 European Patent Application). Ces composés sont en cours d'évaluation dans divers modèles cellulaires (apoptose, neurodégénérescence) et animaux. De tels inhibiteurs pourraient avoir un impact sur le traitement de la maladie d'Alzheimer et plus largement des Taupathies, puisque le groupe de Karen H Ashe (Minneapolis, USA) a montré que la Casp2 est directement impliquée dans la dysfonction synaptique induite par Tau, et que la prévention du clivage de Tau (Asp314) par la Casp2 peut reverser le déficit cognitif (Zhao et al, 2016Nat Med).

Axe 2 : Rôle du Nicotinamide Riboside et son métabolisme dans la dégénérescence axonale

Ce thème s’inscrit dans l’étude du métabolisme énergétique et notamment du rôle du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) dans la prévention des processus de dégénérescence cellulaire. De récentes études au sein de notre équipe montrent que le NAD+, un cofacteur issu de la vitamine B3, peut ralentir la dégénérescence des synapses et d’axones survenant lors de différents stress cellulaires (Magnificoet al.,2013 ; Delégliseet al., 2013). Alors que les taux de NAD+cérébral diminuent fortement dans certains modèles animaux de la maladie d'Alzheimer (Ghoshet al., 2012), nous nous intéressons aux effets d’un apport de NAD ou de ses précurseurs dans la prévention de la dégénérescence axonale survenant lors de stress neurotoxiques associés au vieillissement. Notamment, le nicotinamide riboside (NR), un précurseur du NAD+apporté par l’alimentation et présent dans le lait, a récemment été décrit comme un potentiel substrat alternatif pour la biosynthèse du NAD+. 

Nos résultats montrent une très forte efficacité du NR dans la prévention de la dégénérescence axonale au sein d'un système de culture microfluidique de neurones de souris soumis à un stress excitotoxique (Vaur et al. 2016). Dans ce modèle, nous avons constaté que la dégénérescence axonale et la mort somatique sont indépendantes des caspases. Nos études en chambres microfluidiques montrent que le NR agit localement au niveau axonal. Nous explorons plus avant le mode d’action du NR et l’implication des enzymes de son métabolisme dans des modèles in vitro e tin vivo de neurodégénérescence (synapse, axone, et soma). 

Axe 3 : Développement de la technologie microfluidique et de méthodes de culture cellulaire à architectures définies

Les méthodes de culture cellulaire conventionnelles (en boites de Pétri, en flasques, plaques et multi-plaques) produisent des agencements aléatoires qui ne permettent pas de mimer les structures organisées des tissus et organes chez les métazoaires. La reconstitution des architectures et du microenvironnement naturel de cellules est donc devenue une quête majeure pour la biologie cellulaire. De nombreuses approches sont possibles et parmi les plus prometteuses on regroupe sous le terme d'organe sur puce (organ-on-chip; OOC) la combinaisons de systèmes les plus miniaturisés possibles et d'architectures cellulaires définies (à 2 ou 3 dimensions). Parmi les OOC, différents organes ou tissus peuvent êtres reconstitués sur des puces qui le plus souvent utilisent la technologie microfluidique.

Notre équipe développe des approches de biologie cellulaire basées sur les avancées récentes en microfabrication et microfluidique. Lorsque ces approches impliquent des neurones, nous les regroupons sous le terme général de Nerve-on-Chip (NOC), un sous-ensemble des OOC. L'une des innovations importantes réalisée par notre équipe est le système de "diode neuronale" (Peyrin et al. 2011 Lab Chip. 11(21):3663-73.; Viovy JL et al., 2008 WO 2010040920 A2): il s'agit de dispositifs de culture, en polydimethylsiloxane (PDMS), à plusieurs compartiments et dont l'architecture est imprimée dans le PDMS par moulage à partir d'un support micro-gravé. Dans le cas des diodes neuronales, c'est l'architecture des chambres de cultures et de leurs connections (micro-canaux) qui, au delà de la miniaturisation, confère des possibilités biologiques auparavant inaccessibles telle que la pharmacologie compartimentée (traitement pharmacologique local sans interférence directe avec les autres compartiments), la reconstruction de connections cellulaires (cocultures) alignées et "orientées" (unidirectionnelles) de cellules excitables (par exemple: un réseau de neurones, ou un réseau neuromusculaire), et la mise au point d'architectures plus complexes avec une combinaison de trois types cellulaires ou plus, en 2D ou en 3D (Brain-on-Chip).

Pour développer ces approches, nous avons établi un ensemble de collaborations avec des équipes de recherche spécialisées en physico-chimie, neurobiologie et physiologie. D'autre part, notre équipe est à l'origine d'une société, MicroBrain Biotech (créé en 2014 ; basée dans l'incubateur ESPCI à l'Institut Pierre-Gilles de Gennes -IPGG-, Paris 75005) qui développe la fabrication de dispositifs microfluidiques et leur utilisation dans le processus de sélection/validation des médicaments (www.microbrainbiotech.com). Nous progressons sur la mise au point de nouveaux NOCs en collaboration avec cette société.